Qualitative Analysis Of Phenylethanol Glycosides And Polysaccharides Of Cistanche Deserticola

QIN Wenting1，2，SU Meifeng1，2，LUO Xiaomei2 ，WANG Xiaoming2 ， XU Rong2 ，CHANG Xiaoyan2 ，CHEN Jun2 ，SHI Yue2 （1.Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029，China； 2.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China）

Abstract：Objective：To qualitatively analyze the contents of phenylethanoid glycosides in Desert Cistanche from different habitats by UPLC；to determine the molecular weight distribution of crude polysaccharides by MALLS，determination of monosaccharide composition by ion chromatography， and compare the differences in the intrinsic quality of Desert Cistanche，providing the comp rehensive evaluation of Desert Cistanche deserticola. Methods：UPLC chromatographic conditions：Column：Waters Acquity UPLC® BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；Mobile phase：acetonitrile（A）-0.1% formic acid water（B），gradient elution cond itions：0-8 min，2% A；8-16 min，12% A；16-19 min， 16% A；19-22 min，16%-22% A；22-25 min，19% A；25-30 min，19%-25% A；30-32 min，25% A； 32-35 min，25%-30% A；35-38 min，30%-40% A；38-40 min，40%-50% A. Ion chromatographic separation conditions：Column：Analytical column：Carbo PacTMPA20（3 mm×150 mm）Analytical； Eluent：250 mmol·L-1 NaOH and 1 mol·L-1 NaAC，gradient elution conditions：A is water， B is 250 mmol·L-1 NaOH，C is 1 mol·L-1 NaAC；0-20 min，94% A，6% B，0C；20-20.1 min， 89% A，6% B，5% C；20.1-35 min，74% A，6% B，20% C；35.1-45 min，20% A，80% B，0 C； 45.1-55 min，94% A，6% B，0C. MALLS measurement conditions：Column：TSK Gel G4000PWxl； mobile phase：0.1 mol·L-1 sodium chloride solution，flow rate：0.5 mg·min-1，injection volume： 200 μL，sample concentration：1 mg·mL-1. Results：By integraling the different origin of Cistanche deserticola UPLC fingerprint peak area，obtaining five phenylethanoid glycosides peak area，and compare with each other；MALLS was used to detect the molecular weight and distribution of crude polysaccharides from Cistanche deserticola，and seven kinds of monosaccharide were detected by ion chromatography. Conclusion：UPLC results showed that the content of phenylethanol glycosides in different crops was different，artificial cultivation of Cistanche content is higher when autumn harvest， the results of MALLS showed that the molecular weight，distribution and monosaccharide composition of polysaccharide were different.

Keywords：Cistanche deserticola；phenylethyl glycosides；polysaccharides；molecular weight； monosaccharide

荒漠肉苁蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）为列 当科多年寄生植物，具有补肾壮阳、润肠通便、延缓 衰老、消除疲劳、提高免疫力、保肝护肝等功效，被 载入《中华本草》《中华人民共和国药典》等医药名 录。荒漠肉苁蓉在内蒙古、新疆、宁夏等地均有分 布[1]，其主要有效成分为苯乙醇苷类和多糖类成分。 从现有的文献报道看，对荒漠肉苁蓉中苯乙醇苷类 成分的研究相对较多，包括指纹图谱的建立、含量的 测定、单体的分离及其生物活性[2-3]，而对其多糖类 成分的研究相对较少。本文运用 UPLC 对不同产地 荒漠肉苁蓉的苯乙醇苷类成分进行定性分析，运用 MALLS[4]测定其多糖分子量与分布，同时运用离子 色谱测定其单糖与糖醛酸组成，三方面综合考察荒 漠肉苁蓉的内在质量并比较其差异，为荒漠肉苁蓉 的科学开发与种植提供参考依据。 1 材料 

1.1 药材来源 

收集以下产地荒漠肉苁蓉，经中国医学科学院 药用植物研究所徐荣副研究员鉴定，均为列当科肉 苁蓉属，药材详细信息见表 1

表 1 样品详细信息

1.2 仪器与试剂 

1.2.1 仪器 

Acquity UPLCTM system（Waters Corp.，USA）； DIONEX ICS-3000 USA（美国戴安公司）；多角度 激 光 检 测 器（Wyatt Technology DAWN EOS，18 角 度）；METTLER-AB135 十万分之一电子分析天平 （METTER-TOLEDO，Switzerland）；RE-2000A 旋 转 蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-250DE 型数控 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q Advantage A10 超纯水系统（美国密里博公司）。

1.2.2 试剂 

乙 腈：色 谱 纯（Honeywell Burdick & Jackson， USA）；甲 酸：色 谱 纯（Dikma Technologies Inc.， Beijing）；屈臣氏饮用水（广州屈臣氏食品饮料有 限公司）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司，批 号：20160706）；氢 氧 化 钠（Sigma-Aldrich，批 号： STBD9065V）；无 水 乙 酸 钠（Sigma-Aldrich，批 号： H1608071）；三氟乙酸（天津市光复精细化工研究 所）；超纯水，其他试剂均为分析纯常规试剂。 

1.2.3 中药对照品 

松果菊苷（纯度：98.88%，批号：MUST-17030701）；2'-乙 酰 毛 蕊 花 糖 苷（纯 度：99.28%，批 号： MUST-17031504）；管 花 苷A（纯 度：98.57%，批 号： MUST-16080111）；毛蕊花糖苷（纯度：99.57%，批号： MUST-17020715）；异毛蕊花糖苷（纯度：99.77%，批 号：MUST-17041816），均购自成都曼思特生物科技 有限公司。 2 方法 2.1 供试品溶液的制备 2.1.1 苯乙醇苷浸膏及粗多糖的制备 

将不同产地荒漠肉苁蓉分别用70%乙醇回流 提取3次，每次1 h，趁热过滤，合并滤液浓缩，真空 干燥得到醇提物，备用；药渣用水提取2次，每次 2 h，趁热过滤，合并滤液，80% 乙醇沉淀得到粗多 糖。 

2.1.2 苯乙醇苷样品的制备 

分别称取上述苯乙醇苷浸膏各30 mg，溶于2 mL （0.1% 甲 酸）水 - 乙 腈（9∶1），过 0.22 μm 滤 膜，得 供试品溶液。 

2.1.3 多糖样品的制备 

分别称取上述粗多糖各10 mg，溶于0.1 mol·L-1 氯化钠溶液，供分子量分析。 

2.1.4 单糖水解液的制备[5-7] 

分别称取多糖样品 10 mg 于水解管中，加入 4 mol·L-1的三氟乙酸 4 mL，充氮 1 min 排出管内空 气，旋紧螺旋盖，于 120 ℃水解 2 h，待冷却后氮气吹 干水解液，除去过量的三氟乙酸，加超纯水定容至 10 mL。稀释相应倍数后，0.2 μm 滤膜过滤制得。 

2.2 色谱条件 

2.2.1 UPLC色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC® BEH C18（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；流 动 相：乙 腈（A）-0.1% 甲 酸 水（B）；流 速 0.3 mL·min-1；进 样 体 积：2μL； 柱 温：30 ℃；梯 度 洗 脱 条 件：0~8 min，2%A； 8~16 min，12%A；16~19 min，16%A；19~22 min， 16%~22%A；22~25 min，19%A；25~30 min， 19%~25%A；30~32 min，25%A；32~35 min， 25%~30%A；35~38 min，30%~40%A；38~40 min， 40%~50%A。 

2.2.2 离子色谱分析条件 

色 谱 柱：分 析 柱：Carbo PacTMPA20（3 mm× 150 mm）；淋 洗液：250 mmol·L-1氢氧化钠溶液和 1 mol·L-1醋酸钠溶液；流速：0.5 mL·min-1；进样体 积：10 μL；柱温：35 ℃；检测器：脉冲安培检测器， 金电极。梯度洗脱条件：A为水，B为250 mmol/L氢 氧化钠溶液，C为1 mol·L-1醋酸钠溶液；0~20 min， 94% A，6% B，0 C；20~20.1 min，89% A，6% B，5% C； 20.1~35 min，74% A，6% B，20% C；35.1~45 min，20% A，80% B，0 C；45.1~55 min，94% A，6% B，0 C。 

2.2.3 多角度激光光散射仪条件 

色谱柱：TSK Gel G4000PWxl；流动相：0.1 mol·L-1 氯化钠溶液；流速：0.5 mL·min-1；进样量：200 μL； 样品浓度：1 mg·mL-1。 

2.3 苯乙醇苷类定性检测方法学考察 

2.3.1 精密度试验 

取内蒙样品在“2.2.1”色谱条件下连续进样 6 次，以 5 个特征峰（R1~R5）为指标，以 R1 为参照峰，计算其相对保留时间和相对峰面积。

2.3.2 稳定性试验 

测 定 16 种 样 品 在 0、14、28 h 后，5 个 特 征 峰 （R1~R5）的相对保留时间和相对峰面积。

2.3.3 重复性试验 

同一产地样品各制备 5 份，在“2.2.1”色谱条件 下分析，以 5 个特征峰（R1~R5）为指标，以 R1 为参 照峰，计算其相对保留时间和相对峰面积。 

3 结果 

3.1 苯乙醇苷类定性检测方法学结果 

3.1.1 精密度试验结果 

计算结果显示各特征峰相对保留时间及相对 峰面积的 RSD 值均小于 3%，表明其精密度良好。 

3.1.2 稳定性试验结果 

在“2.2.1”色谱条件下，16 种样品在 0、14、28 h 后其各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的 RSD 值均小于 3%，显示 16 种样品稳定性良好。 

3.1.3 重复性试验结果 

取各特征峰（R1~R5）的相对保留时间及峰面 积计算 RSD，结果表明，RSD 值均小于 3%，表明样品 重现性良好。 

3.2 不同产地荒漠肉苁蓉指纹图谱相似度评价 

将“2.1.2”项制得的供试品溶液在 UPLC 色谱 条件下进行分析，所得结果导入《< 中华人民共和国 药典 > 指纹图谱相似度评价系统 A 版》，建立对照图 谱，见图 1，根据谢洁娜等[8]的研究，我们推测保留时 间为 5 min 左右出现的 4 个小峰为国产荒漠肉苁蓉 的特征峰。

指纹图谱相似度结果[9-11]见表 2，分析可知，不 同批次间荒漠肉苁蓉相似度差异较大，其中且末 1、 且末 2、于田 2、阿拉善西部指纹图谱相似度较高，均 高于 0.9，其次为木垒，为 0.89，，其余产地相似度均 低于 0.5。

注：R1：松果菊苷；R2：毛蕊花糖苷；R3：管花苷 A；R4： 异毛蕊花糖苷；R5.2' 乙酰毛蕊花糖苷

图 1 荒漠肉苁蓉对照图谱 

表 2 荒漠肉苁蓉指纹图谱相似度结果

3.3 不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷类成分相对含量 分析 

将制好的供试液样品在“2.2.1”项色谱条件下 分析，得到 16 种 UPLC 图，以松果菊苷、毛蕊花糖苷、 管花苷 A、异毛蕊花糖苷和 2'- 乙酰毛蕊花糖苷为特 征峰进行比较，见图 2~ 图 3。

3.3.1 新疆不同产地荒漠肉苁蓉不同采收季节（春、 秋）苯乙醇苷类成分相对含量分析 

如图 2 所示，于田 2、且末 1、且末 2 为秋季采收， 其余产地为春季采收，5 种苯乙醇苷含量分布中，秋 季采收含量明显高于春季，这与庞金虎等[12]研究结 论相一致。这是由于经过春夏秋的旺盛生长，初秋 开始，肉苁蓉地下根茎的营养物质开始积累，有效成 分含量增高，且秋季气候低温干燥，有助于药材前处 理，所以秋季采收时间为 10 月下旬至 11 月上旬。另 外，春季采收应在 3 月下旬至 4 月上旬，防止抽薹营 养物质的消耗。此外，来自于新疆和田博远基地、且 末治沙站、阿克苏沙雅的肉苁蓉样品为鲜品，5 种苯 乙醇苷含量很低，说明药材采收后，干燥过程对有效 成分的积累有较大的影响[13]。

图 2 新疆荒漠肉苁蓉不同采收季节苯乙醇苷类成分分布

3.3.2 新疆不同产地野生与人工栽培荒漠肉苁蓉苯 乙醇苷类成分相对含量分析 

如图 3 所示，奇台及木垒为野生样品，其余产地 均为栽培样品，人工栽培荒漠肉苁蓉中，采自且末 1、且末 2、于田 2 的 5 种苯乙醇苷相对含量均高于野 生，其余采自哈密、精河等地的与野生相比，5 种苯 乙醇苷分布各有差异，无明显规律。其中松果菊苷 与毛蕊花糖苷的变化与黄晶[14]、徐荣等[15]的研究发 现略有差异，这可能由于采样地点的不同，以及肉苁 蓉的生长环境、寄主梭梭生长情况、肉苁蓉生长年 限、种子质量等各方面的差异所造成。

图 3 新疆不同产地野生与人工栽培荒漠 肉苁蓉苯乙醇苷类成分分布

3.3.3 内蒙及宁夏苯乙醇苷类成分相对含量分析 

如图 4，阿拉善左旗沙漠与右旗沙漠样品为野生肉苁蓉，但阿拉善右旗苯乙醇苷含量显著高于左 旗含量，经回访，阿拉善右旗沙质污染少，且肉苁蓉 生长年限约为 5~10 年，以及寄主梭梭的生长状况不 同，都可能是引起苯乙醇苷含量差别较大的原因。 且观察 16 种产地苯乙醇苷分布图发现，酒制后苯乙 醇苷含量呈现最低，这可能因为，在炮制过程中，高 温高压以及酒制时间的长短都会引起苯乙醇苷类含 量的降低[16]。

图 4 内蒙及宁夏苯乙醇苷类成分分布

3.3.4 不同产地荒漠肉苁蓉粗多糖分子量及其分布 

将“2.1.3”项下制得供试样品，用多角度激光散 射仪在“2.2.3”条件下进行分子量的测定，结果见表 3。分析表 3，不同产地荒漠肉苁蓉多糖分子量大小 与分布均有差异，采自新疆木垒、阿克苏沙雅、内蒙 阿拉善左旗、右旗及同仁堂的样品分子量出现均一 性分布（除阿克苏沙雅、同仁堂样品外其余产地样品 均为野生），进一步观察表 3 发现，除新疆和田博远 基地样品外，春季采收的样品分子量分布较秋季更 加集中，所以，我们推测样品的来源、采收季节与多 糖分子量的分布有关。

此外，肉苁蓉酒制后多糖样品分子量也偏小， 酒制是否会影响多糖的分子量大小及分布，需要进 行更加深入细致的试验。 

高云佳等[17]研究表明，肉苁蓉寡糖为润肠通便 的药效物质之一，而不同分子量段的多糖，其抗氧化 活性、抗衰老活性及降血糖作用差异明显[18-22]，可为 肉苁蓉寡糖的制备及后续药效活性研究提供参考依 据。